非洲猪瘟病毒和古典猪瘟病毒双重PCR及双重荧光PCR检测方法的建立与应用

非洲猪瘟病毒和古典猪瘟病毒双重PCR及双重荧光PCR检测方法的建立与应用
作 者 : 张倩
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 硕士
外文题名 : Duplex PCR and Double Real-time PCR for Detection of African Swine Fever Virus and Classical Swine Fever Virus
导师姓名 : 王志亮;刘秀梵
学位年度 : 2010
关键词 : 非洲猪瘟病毒;猪瘟病毒;双重PCR;双重荧光PCR;VP72基因;5’UTR
摘 要 : 非洲猪瘟和古典猪瘟都是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类动物疫病。这两种疫病都具有传播速度快,破坏性强的特点,是严重危害畜牧业健康发展和畜产品国际贸易的烈性传染病。我国目前属于非洲猪瘟非疫区,猪瘟疫区。但是近几年,非洲猪瘟在许多与亚洲接壤的欧洲国家频繁爆发且有不断蔓延趋势,使我国对该病的防控形势越来越严峻。由于非洲猪瘟和古典猪瘟的临床症状极其相似,所以必须加强对非洲猪瘟的监测防止其传入我国。在当今世界贸易发展迅速情况下,快速、灵敏的分子生物学方法就显得尤为重要。为此,本研究建立了两种可同时检测这两种病毒的PCR方法,可对进出口的猪肉及其制品进行严格的鉴别诊断,为我国畜牧业的健康发展提供有利的技术支持。参照GenBank中ASFV Tengani 62分离株(登录号AY261364)VP72蛋白的基因序列分别合成两段基因片段p-ASFV-vp72和q-ASFV-vp72作为PCR和荧光PCR的反应模板,引物和探针参照《OIE陆生动物诊断实验和疫苗手册》非洲猪瘟一章合成,将引物和探针序列在NCBI网站中进行Blast分析比较和评估,保证引物与探针的特异性,扩增片段分别为278bp和249bp。另根据GenBank中登录的CSFV C株的全基因组序列,利用DNAStar中的MegAlign软件进行排序、分析和比对,发现其5’UTR具有高度的保守性,在DNAStar的PrimerSelect和ABI primer express 3.0软件中分别进行PCR引物与荧光PCR引物和探针的设计和分析。由于双重荧光PCR反应中多条引物与探针之间的相互影响比单一荧光PCR复杂,因此特别关注了引物与探针之间的二级结构关系。针对此区域的序列设计的两对引物和一条探针分别用于PCR和荧光PCR体系,扩增片段分别为438bp和120bp。在检测ASFV的探针5’端和3’端分别标记了FAM荧光素和TAMRA荧光素,在检测CSFV的探针5’端和3’端分别标记了VIC荧光素和TAMRA荧光素。由于ASFV是DNA病毒而CSFV是RNA病毒,所以先构建了一个含有目的片段的CSFV的阳性质粒,这个阳性质粒也包含着荧光PCR反应针对的序列,所以既可以作为PCR反应的模板也可以作为荧光PCR反应的模板。通过对双重PCR引物浓度、退火温度等反应条件的优化,筛选出最佳反应条件,建立双重PCR检测方法。对于双重荧光PCR,主要对引物和探针的浓度比进行优化,通过矩阵法筛选出最佳引物与探针的浓度比,建立双重荧光PCR检测方法,并对这两种方法的特异性、敏感性和重复性进行了测定。结果表明:只有特异性引物与其特异性模板才能扩增出目的片段,用此法检测蓝耳病病毒(PRRSV),乙脑病毒(JEV),圆环病毒(PCV),细小病毒(PPV)伪狂犬病毒(PRV)结果均为阴性,说明这两种方法都具有良好的特异性。对梯度稀释的阳性质粒的检测可知所建立的荧光PCR方法对ASFV最低可检测出10个拷贝,CSFV最低可检出100个拷贝,普通PCR只能检测到ng级别,说明荧光PCR方法敏感性比普通PCR方法至少高10倍。对从山东胶东地区猪场采集的156份猪的血样和猪病料用双重PCR进行检测未发现有ASFV,有28份CSFV为阳性,阳性率为17.9%,这与单一PCR检测的结果相符合,用双重荧光PCR对相同的样本进行检测,也没有发现ASFV,有30份CSFV为阳性,阳性率为19.2%,对PCR检出为阴性而荧光PCR检出为阳性的病料进行重复检测并测序。

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