非洲猪瘟病毒蛋白p54原核真核表达、间接ELISA检测方法建立及单克隆抗体制备

非洲猪瘟病毒蛋白p54原核真核表达、间接ELISA检测方法建立及单克隆抗体制备
作 者 : 梁云浩
学位授予单位 : 暨南大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 唐勇
学位年度 : 2014
关键词 : 非洲猪瘟病毒;蛋白p54;间接ELISA;单克隆抗体
摘 要 : 目的:利用PET原核表达系统和pFastBac/NT-TOPO真核表达系统分别表达出非洲猪瘟病毒蛋白p54,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。同时制备p54的单克隆抗体。方法:将非洲猪瘟病毒蛋白p54的基因克隆到原核表达载体pET-52b(+)3C/LIC上,再转入大肠杆菌BL21(ED3)中,获得重组表达蛋白p54。超声破碎菌体,取离心后上清进行SDS PAGE和Western blot分析。优化诱导表达条件,利用表达蛋白上的六组氨酸标签进行蛋白纯化,获得高纯度的p54。将纯化后的p54包被酶标板,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。将非洲猪瘟病毒蛋白p54基因克隆到真核载体pFast/NT-TOPO上,转入大肠杆菌DH5α中,扩大培养后涂布抗生素筛选平板,挑取生长的单克隆菌落获得重组质粒,经PCR鉴定正确后,转入大肠杆菌DH10Bac中,获得重组杆状病毒质粒。利用脂质体介导,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染sf9细胞,72h后收集细胞,超声破碎,取离心后上清进行SDS-PAGE和Western-blot分析。用上清包被酶标板,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。用原核表达的p54免疫小鼠,用真核表达的p54进行杂交瘤细胞筛选,采用传统化学融合和有限稀释法制备出p54的单克隆细胞株。结果:真核、原核表达系统均表达出非洲猪瘟病毒蛋白p54,经Western-blot分析,重组蛋白可以和标准阳性血清反应,有良好反应性。基于原核/真核表达p54的间接ELISA方法,可以分别检测出1:1280和1:320倍稀释的标准阳性血清。批内、批间变异系数分别小于10%和15%。检测96份血清样品与商品化试剂盒的符合率分别为90.1%和84.4%。检测的灵敏性均为100%。特异性分别为88.2%和80.3%。融合细胞经筛选后获得阳性克隆株,并制备出p54的单抗。结论:成功建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法,建立的方法具有灵敏、特异、稳定,操作简便的特点,同时制备了p54的单克隆抗体,为非洲猪瘟病原的检测做好了技术储备。

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