猪瘟病毒复合PCR检测方法的建立和应用

猪瘟病毒复合PCR检测方法的建立和应用
作 者 : 孙彦婷
学位授予单位 : 河南农业大学
学位名称 : 硕士
外文题名 : Development and Application of Multiplex PCR for the Detection and Differentiation of Classical Swine Fever Virus
导师姓名 : 王川庆
学位年度 : 2009
关键词 : 猪瘟病毒;猪瘟兔化弱毒疫苗;复合PCR;鉴别诊断;非洲猪瘟
摘 要 : 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,被世界动物卫生组织列入OIE疾病名录(OIE Listed diseases),为须申报的(notifiable)动物传染病。近年来,我国猪瘟成为影响养猪业发展的一大隐患。CSFV跟同属的牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)和绵羊边界病病毒(BVD)都属于黄病毒科(Flaviriridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员,由于瘟病毒属其它成员大都可以感染猪,与CSFV存在血清学交叉反应,而非洲猪瘟(ASF)在临床上与猪瘟有很多相似之处,这些都给猪瘟诊断造成一定干扰。 @@ 疫苗免疫接种是预防猪瘟的主要措施。猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)在我国的大规模应用,为控制猪瘟起到了重要作用,但同时也给传统的诊断方法特别是对CSFV野毒感染猪和疫苗接种猪的鉴别诊断带来较大困难。目前,我国猪瘟兔化弱毒疫苗的生产中兔脾淋疫苗质量呈下滑趋势,疫苗所必须的兔源大量减少,制备工艺粗糙,难以达到我国制定的疫苗效价的标准。猪瘟兔化弱毒细胞苗原定毒价标准只是国外标准的1/3,毒价低,若按说明剂量应用免疫效果差,达不到亚临床保护效果。为了了解不同厂家的猪瘟兔化弱毒疫苗的效价,建立了检测了CSFV的PCR方法,并进行了初步估测。结果表明,13个不同厂家不同批次的16份疫苗中PCR的扩增结果存在着较大差异,约1/3疫苗效价较低,免疫接种后很可能导致免疫失败,起不到预防猪瘟的作用;而且同一厂家不同批次的疫苗效价有较大差异,批次间质量不稳定。 @@ 本研究通过对GenBank中公布的34株CSFV野毒和疫苗毒基因组序列的比较分析,参照CSFV基因序列(AY805221),针对CSFV E2基因A1区域设计合成了一对引物,以HCLV疫苗株为模板,建立了CSFV的RT-PCR检测方法。利用建立的方法检测PRV、PPV、PCV-2,只有CSFV扩增出预期的276bp的条带,而其它病毒未出现任何条带,说明了所建检测方法的高度特异性。运用所建方法对河南新乡、周口、焦作等地CSFV病料进行RT-PCR扩增,均可得到与预期大小276bp相符的特异性片段,同时用Hinf Ⅰ对胶回收后的PCR扩增产物进行酶切鉴定,产物可被酶切成与预期大小相符的83bp和193bp两条片段。 @@ 在上述RT-PCR的基础上,通过对GenBank中公布的34株CSFV野毒和疫苗毒基因组序列的比较分析,在其保守区并包含强、弱毒差异性位点的5'端非编码区(可作为强毒与弱毒分子鉴别诊断的靶区域)设计了一对针对猪瘟疫苗毒的特异性引物,从而建立了能区分CSFV野毒和疫苗毒的复合RT-PCR鉴别诊断方法。 @@ 非洲猪瘟与典型的猪瘟都是急性、热性、败血性传染病,临床诊断上很易把二者相混淆。2007年4月-2008年7月先后有格鲁吉亚、俄罗斯、车臣共和国、赞比亚、阿塞拜疆、坦桑尼亚等国家暴发非洲猪瘟疫情。我国目前虽是无ASFV感染的国家,但是作为俄罗斯的邻 国,时时刻刻都有被ASF波及的可能,因而对ASFV的及时排查诊断和实时监控显得尤其有重要意义。为了及时排查ASFV感染的可能性,本研究设计了该试验,在区分CSFV野毒和疫苗毒的复合PCR方法的基础上,建立了能同时鉴别ASFV和猪瘟强弱毒株的三重PCR方法,在有效区分猪瘟强毒和弱毒的同时,简便快捷的实时监控非洲猪瘟在我国的流行动态。试验排查结果表明,目前河南各地的猪瘟尽管发生不断,但不存在有ASFV的感染。

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