非洲猪瘟病毒VP72基因检测方法的建立及VP73蛋白研究

非洲猪瘟病毒VP72基因检测方法的建立及VP73蛋白研究
作 者 : 李洪利
学位授予单位 : 内蒙古农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 曹金山;王君玮
学位年度 : 2012
关键词 : 非洲猪瘟;实时荧光定量PCR;原核表达;多克隆抗体
摘 要 : 非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)是一种强传染性的病毒,可引起家猪的急性、致死性传染病。对养猪业可造成巨大的经济损失。本研究成功建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法,并制备了VP73主要抗原表位区融合蛋白的多克隆抗体,为非洲猪瘟VP73蛋白后续免疫学研究奠定了基础。为了建立一套检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank公布的23株编码ASFV结构蛋白p72的基因序列,设计引物和探针,优化退火温度、mg2+浓度和引物探针浓度,生成标准曲线,进行重复性、敏感性、特异性试验,并检测样品。结果显示,优化的退火温度为60℃,mg2+终浓度为4mmol/L,引物探针终浓度分别为0.8μmol/L和0.3μmol/L。重复性试验变异系数均小于1.3%,敏感性试验最低能够检测到10拷贝的质粒,以其他5种猪病病毒和ASFV质粒为模板进行特异性试验,只有ASFV质粒出现扩增曲线。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏、特异的检测ASFV的方法。构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0mmol/,诱导5h蛋白表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子量约为42kD。蛋白纯化后,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1:1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。

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