非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其衣壳蛋白P72的原核表达

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其衣壳蛋白P72的原核表达
作 者 : 李维彬
学位授予单位 : 宁夏大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王玉炯;蒋正军
学位年度 : 2006
关键词 : 非洲猪瘟病毒;TagMan探针;实时荧光定量PCR;衣壳蛋白P72;原核表达
摘 要 : 本论文由两部分组成,一是非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立;二是非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72在大肠杆菌中的表达。主要试验和结果如下: 1.为建立一种快速、准确、特异的ASFV定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,借助计算机辅助,对ASFV基因序列进行分析并利用Beacondisigner软件对检测引物和探针进行了优化筛选;利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的退火温度、镁离子、引物、探针浓度等参数进行了优化并对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,同时通过对田间样品的检测对本方法的检测效果进行检验,建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法。经优化,荧光PCR反应中退火温度、Mg2+、探针和引物的最佳浓度分别为52℃、4.5mmo/L、500nmol/L和400nmol/L,最低检出量为102个拷贝数的质粒,特异性为100﹪,Ct值的CV小于5﹪。对送检的15份猪肉样品进行检测,结果全为阴性。上述结果表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASF病毒核酸进行定量分析,从而为ASF的预防提供了一个更新、更为可靠的检测方法。 2.利用PCR技术,从含非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因的克隆质粒BBBBPr4中扩增出1.94kb的P72基因。将P72基因和表达载体pET-30c(+)分别用限制性核酸内切酶FhaⅠ/XHoⅠ和BamHⅠ/XHoⅠ进行双酶切,然后在T4DNA连接酶作用下,将P72基因定向克隆至载体pET-30c(+)中相应位点上,并转化至宿主菌BL21(DE3)中,得到了重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)。经PCR鉴定,构建的重组菌株中含有P72基因。重组菌株BL21(DE3)(pET-ASFVP72)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析,结果表明衣壳蛋白P72基因可以在受体菌中高效表达,达到了菌体总蛋白的34﹪,表达产物的分子量约为78kD,并能被ASFV抗体所识别。

      • 温馨提示:
      • 在微信、微博等APP中下载时,会出现无法下载的情况
      • 这时请选择在浏览器中打开,然后再请下载浏览
361图书馆,资源府邸,学习的天地
361图书馆 » 非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其衣壳蛋白P72的原核表达

Optimized by WPJAM Basic