4周前 (10-22)  动物疾病研究与防治相关 |   抢沙发  2 
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非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备
作 者 : 冯尧
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 孙怀昌
学位年度 : 2014
关键词 : 非洲猪瘟病毒;p54蛋白;原核表达;单克隆抗体
摘 要 : 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染引起的猪的高度接触传染性疾病,死亡率高达100%。ASF长期在非洲流行,近年来流行范围有逐渐扩大的趋势,目前已经蔓延至俄罗斯等邻国,使我国养猪业面临巨大威胁。ASF无任何疫苗用于防疫,因此建立快速、准确的诊断方法对于防止该病传入和扩散具有重要意义。p54是ASFV的重要结构蛋白,具有较强的免疫原性,因此常被用来检测抗原,同时用重组蛋白代替活病毒抗原增加了检测的安全性。本研究通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增ASFV p54基因,插入原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET30a-P54转化BLR(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达的His-p54融合蛋白为预期的21kD,且为可溶性表达。用镍亲和层析柱纯化表达产物,得到了纯度较高的His-p54融合蛋白。用纯化的His-p54蛋白免疫BALB/c小鼠,采集脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA进行杂交瘤细胞阳性克隆筛选,用有限稀释法进行3次亚克隆,得到2株能稳定分泌p54蛋白单克隆抗体的细胞株。以重组p54蛋白为抗原,经Western-blot和间接免疫荧光试验检测证明,获得的单克隆抗体能与抗原特异性结合;用2株杂交瘤细胞制备腹水单抗,其ELISA抗体效价分别达216和213。

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