非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及其杆状病毒载体疫苗的构建

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及其杆状病毒载体疫苗的构建
作 者 : 靳雯雯
学位授予单位 : 华中农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 曹胜波
学位年度 : 2014
关键词 : 非洲猪瘟;非洲猪瘟病毒;VP73蛋白;单克隆抗体;间接ELISA;重组杆状病毒;哺乳动物细胞
摘 要 : 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染引起猪和野猪的一种以高热、淋巴及内脏器官严重出血为特征的急性、热性、高度接触传染性疾病。我国面临ASF传入的风险,因此,开展该病的诊断方法和疫苗的储备技术研究具有重要的意义。本研究利用基因工程表达的ASFV主要抗原性结构蛋白VP73和标准阳性血清为主要材料,建立了可用于大规模检测猪血清临床样品中ASFV抗体的间接ELISA方法,为ASFV抗体检测提供了有效的实验室诊断方法,同时本研究构建了表达ASFV VP73基因的重组杆状病毒,为ASFV新型疫苗研究奠定基础。具体研究内容如下:1. ASFV VP73蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备合成ASFV VP73全序列构建原核表达载体pGEX-KG-VP73,转化BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Western blot实验证实诱导表达的VP73蛋白可以与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。利用纯化的VP73蛋白免疫4周龄BALB/c雌性小鼠制备单克隆抗体。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,并最终获得了两株稳定分泌抗VP73蛋白特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1E6和1H3,抗体亚类鉴定分别为IgG2b和IgG1,轻链均为K链。通过间接免疫荧光实验和Western blot分析证实,获得的两株单克隆抗体均能与VP73蛋白发生特异性反应。2. ASFV间接ELISA抗体检测方法的建立以VP73纯化蛋白作为包被抗原,ASFV标准阳性/阴性血清样品为检测样品,HRP标记的兔抗猪IgG为二抗,建立ASFV间接ELISA抗体检测方法。结果表明,本方法对ASFV标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1:2560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;包被的酶标板在37℃放置5天后,对同1份阳性/阴性血清的检测敏感性无明显变化;与进口商品化阻断ELISA抗体检测试剂盒相比,本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,两种方法检测结果的kappa数据值为0.944,符合率较高。3. ASFV VP73基因杆状病毒载体疫苗的构建本研究根据已发表的ASFV序列,设计合成VP73基因全序列,以巨细胞病毒极早期启动子(CMV)和经水泡性口炎病毒G蛋白(VSV/G)修饰过的pFastBacI杆状病毒为载体构建了重组杆状病毒AcNPV-G-VP73. Western blot结果表明,该病毒感染BHK-21哺乳动物细胞后,VP73基因在细胞中获得表达。本研究构建的重组杆状病毒能够介导ASFV VP73蛋白在哺乳动物细胞中表达,为ASF新型疫苗的探索研究奠定了基础。

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