非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条的研制
作 者 : 吴海涛
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 成大荣
学位年度 : 2015
关键词 : 非洲猪瘟病毒;抗体;免疫金;免疫层析;试纸条
摘 要 : 非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染性疾病。其临床特征主要为全身出血、呼吸障碍和神经症状,发病率和死亡率高,对养猪业的危害巨大。且目前尚无有效的疫苗用于该病的预防,主要通过检疫后扑杀来控制其爆发和流行。因此,建立科学有效的检测诊断方法对于非洲猪瘟的防范具有重要意义。为获得ASFV P72,融合蛋白,本研究利用前期研究中构建的重组菌株pET-30a-P72(BL21)接种到LB液体培养基,以IPTG进行诱导后,收集菌体并以超声波进行裂解,裂解物经SDS-PAGE分析,证明了该P72融合蛋白可以在大肠杆菌BL21中大量表达。通过免疫印记技术分析可知,该融合蛋白可以与鼠抗His标签单抗特异性反应,将表达的P72重组蛋白经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。复苏本实验室保存的抗ASFV的杂交瘤细胞株2D3,扩大培养后接种于10周龄以上经产BALB/c小鼠,采用体内腹水诱生法制备了含有抗ASFV单抗的腹水。将收集的ASFV抗体分别经饱和硫酸铵法、辛酸一硫酸铵联合沉淀法、protein G柱亲和层析法进行纯化,对纯化后的抗体经SDS-PAGE比较分析,最终选择纯化效果较好的protein G柱亲和层析法。纯化后的抗体经紫外分光光度仪测定浓度,并用已建立的间接ELISA法测定其效价,单抗为1:160000,多抗为1:51200。为制备ASFV胶体金免疫层析试纸条,研究中采用直径为30nm的胶体金颗粒标记纯化后的单抗2D3作为金标抗体,以纯化后的多抗固定于NC膜上作为检测线,其最佳浓度为1.47 mg/mL;将葡萄球菌A蛋白(SPA)固定于NC膜上作为质控线,其最佳浓度为1.0 mg/mL,组装成用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条。以pET-30a和PGEX-6P-1为载体表达的ASFV P72蛋白(简称P3P蛋白和PXP蛋白)作为阳性样品,PBS缓冲液、生理盐水、蒸馏水等作为阴性样品来检测试纸条。结果显示阳性样品有明显的两个条带,而阴性样品只显示一个条带,且试纸条能检测到的P3P蛋白和PXP蛋白的最低浓度分别为45ng/mL和60ng/mL。

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