Rap2b在p53突变的肿瘤细胞中的功能研究

Rap2b在p53突变的肿瘤细胞中的功能研究
作 者 : 韦治明
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 张新跃
学位年度 : 2018
关键词 : 肿瘤;p53突变体;Rap2b;促生存功能;调控
摘 要 : 肿瘤抑制基因p53在肿瘤的发生及发展过程中发挥着极其重要的作用。作为突变频率最高的抑癌基因之一,p53在50%以上的人类肿瘤中发生突变,并在肿瘤细胞内维持较高水平。Rap2b是Ras癌基因超家族和p53的新靶基因,在大多数肿瘤细胞中高表达。我们推测,肿瘤细胞中较高水平的突变p53蛋白仍在一定程度上保留了对Rap2b的诱导能力,因而表达较高水平的Rap2b,从而促进肿瘤细胞的存活。本研究旨在探讨Rap2b在p53突变的肿瘤细胞中的功能、Rap2b表达水平与p53突变之间的关系及其可能的分子基础,为深入理解Rap2b和p53在肿瘤细胞发生发展过程中的作用提供重要实验依据。首先,本研究参照UMD数据库中各种肿瘤的p53热点突变资料,选择46个突变位点和突变方式,设计一系列p53突变引物构建p53突变体,转染重组质粒至HCT116(p53-/-)细胞,并利用免疫印迹法检测突变体的表达情况。结果显示,31个p53突变体在该细胞中存在高水平表达。接着,选取能成功表达p53突变体的质粒包装慢病毒,感染人结直肠癌细胞HCT116(p53-/-),经抗生素筛选后,获得稳定表达各种p53突变体的细胞株。利用免疫印迹法检测Rap2b和p53的表达水平,以揭示不同p53突变体与Rap2b表达水平之间的关系。结果表明,p53某些位点的突变能提高肿瘤细胞内Rap2b的蛋白水平。然后,选取两个代表性的p53突变(p53R175H和p53R273H)细胞株,稳定敲低细胞内Rap2b的表达水平,观察Rap2b的敲低对p53突变肿瘤细胞株生长速率、迁移能力、致瘤性、阿霉素处理前后细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,Rap2b敲低后p53突变肿瘤细胞的生长速率、致瘤性和细胞迁移能力显著降低,但是对细胞凋亡和细胞周期没有明显影响。最后,为探明p53突变肿瘤细胞表达高水平Rap2b蛋白的原因,我们研究了在p53野生型和突变型肿瘤细胞中调控Rap2b表达方式的差异。通过用Nutlin-3处理p53野生型及突变型肿瘤细胞,并在撤除Nutlin-3后的不同时间点用免疫印迹法检测p53和Rap2b的蛋白水平,我们发现在p53突变的肿瘤细胞中,p53突变体蛋白在Nutlin-3撤除后仍在较长时间范围内维持较高水平,并且p53在不同程度上丢失了对某些靶基因如p21的诱导作用,但仍然能诱导一些靶基因如Rap2b、Hdm2、Bax和Puma等的表达。我们还通过Pulldown实验发现,p53的突变严重阻碍p53与Rap2b的直接结合。综上所述,本研究揭示p53突变通过显著提升肿瘤细胞中p53突变体蛋白的稳定性,使肿瘤细胞中的Rap2b蛋白维持在较高水平,从而促进肿瘤细胞的生存。这一发现对于制定有效的人类癌症治疗策略具有重要意义。

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