miR-101对肿瘤细胞辐射敏感性的影响和机制研究

miR-101对肿瘤细胞辐射敏感性的影响和机制研究
作 者 : 史盼影
学位授予单位 : 苏州大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 张保国
学位年度 : 2017
关键词 : 肿瘤;细胞辐射敏感性
摘 要 : 目的:本研究课题以人宫颈癌细胞HeLa为对象,通过体外转染miR-101 mimic(miRNA模拟物)的方法在HeLa细胞中过表达miR-101,检测miR-101过表达对X射线照射后的HeLa细胞的存活率的影响,探究miR-101对HeLa细胞辐射敏感性的影响;通过观察过表达miR-101对X射线照射引起的HeLa细胞DNA损伤修复的影响及过表达miR-101的HeLa细胞中ATM和DNA-PKcs蛋白表达量的变化,探究miR-101对HeLa细胞辐射敏感性影响的作用机制。为研制新的提高肿瘤放射治疗效果的药物提供依据。方法:通过脂质体转染miR-101 mimic的方法在HeLa细胞中过表达miR-101,用实时定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-101的过表达情况;用CCK-8法和克隆形成法分别检测Hela细胞的存活率,研究miR-101对Hela细胞的短期和长期毒性;用克隆形成实验检测miR-101过表达联合X射线照射对HeLa细胞存活率的影响,研究miR-101对HeLa细胞辐射敏感性的影响;通过γ-H2AX免疫荧光法检测HeLa细胞DNA双链断裂情况,用Western Blot实验观测ATM和DNA-PKcs蛋白表达量变化,研究miR-101影响HeLa细胞的辐射敏感性的机理。结果:(1)qRT-PCR实验结果显示:不同条件处理HeLa细胞0h、24h、36h、48h、60h、72h后,把不同条件处理后0h组中miR-101的表达量均设为1.00±0.00,随着转染时间的增加,阴性对照组中miR-101的相对表达量无明显变化(P>0.05),而实验组中miR-101的表达量先随转染时间的增加而升高,在48h时达到最高(t=19.71,P0.05),阴性对照组与实验组之间细胞存活率存在明显差异(F=7.72,P0、Dq值见表5,结果显示实验组细胞的D0、Dq值低于空白对照组(p0、Dq值与阴性对照组相比无明显差异(P>0.05),表明miR-101过表达可以增加Hela细胞的辐射敏感性,miR-101对Hela细胞的SERD0、SERDq分别为1.20、1.29。(4)DNA损伤实验结果显示:经miR-101 mimic或miR-NC mimic处理48h后,未使用X射线照射,空白对照组、阴性对照组和实验组细胞细胞核内DNA双链断裂所产生的荧光焦点数量分别为3.10±0.27、2.02±0.31、2.94±0.32;使用4Gy X射线照射后2h,空白对照组、阴性对照组和实验组细胞细胞核内DNA双链断裂所产生的荧光焦点数量分别为11.80±0.35、12.38±0.39、29.82±0.73。未照射组各组之间的荧光焦点数无明显差别(P>0.05);照射后,与空白对照组相比,实验组细胞细胞核内DNA双链断裂所产生的荧光焦点数量明显增加(t=22.36,P0.05)。(5)Western blot结果显示:体外转染miR-101 mimic 48h后HeLa细胞中ATM和DNA-PKcs蛋白表达与空白对照组相比明显下调,阴性对照组与空白对照组相比ATM和DNA-PKcs蛋白表达水平无明显差异。表明,HeLa细胞中过表达miR-101能抑制ATM和DNA-PKcs蛋白的表达。结论:(1)体外转染miR-101 mimic 48h,HeLa细胞中miR-101的表达量最高,在下面的实验中以可以显著提高HeLa细胞中miR-101表达量的48h作为miR-101mimic的处理时间。(2)miR-101 mimic对HeLa细胞有明显的短期和长期毒性作用,说明miR-101mimic对HeLa细胞的生长有抑制作用。(3)miR-101过表达能增加HeLa细胞的辐射敏感性,辐射增敏比为1.29。(4)miR-101过表达的HeLa细胞细胞核内DNA双链断裂所产生的荧光焦点数量明显增加,而与DNA损伤修复相关的两个蛋白ATM和DNA-PKcs表达量明显减少,说明miR-101是通过抑制辐照后DNA损伤修复提高辐射敏感性。

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