MicroRNA 483对肿瘤IGF2基因印记表达的调控及机制

MicroRNA 483对肿瘤IGF2基因印记表达的调控及机制
作 者 : 张益群
学位授予单位 : 吉林大学临床医学院第一学院
学位名称 : 博士
导师姓名 : 李薇
学位年度 : 2017
关键词 : IGF2基因印记;肿瘤;表观遗传;组蛋白K27甲基化;等位基因表达
摘 要 : 研究背景:胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ),是一个促细胞分裂分子,具有促进生长和代谢的作用。正常情况下,IGF-Ⅱ主要在胚胎和人类肝脏中表达,而在多种人类恶性肿瘤中存在异常表达。IGF-Ⅱ通过自分泌、旁分泌和内分泌通路,结合一型IGF受体(IGF1R),促进MAPK和/或PI3-K/AKT信号通路,减少肿瘤细胞凋亡,促进细胞增殖和耐药。所以,人们将IGF2和IGF1R作为肿瘤特异性基因治疗的靶点进行研究。编码IGF-Ⅱ的基因,IGF2,位于染色体11p15,是一个母源印记的基因。个体出生后,IGF2表达受四个启动子调控;启动子P1启动双等位基因表达,而P2-P4刺激除了脑组织之外其他组织中的父源单等位基因表达。单等位基因表达受等位基因特异性表观调节,该调节元件名为印记控制区,在染色体11p15.5上,位于IGF2和H19之间。失去IGF2基因印记(LOI),即双等位基因都表达,是很多人类肿瘤的标志,尤其是儿童肿瘤和肿瘤干细胞。LOI与增加IGF1R信号通路敏感性、加速肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞耐药性相关。研究目的:在IGF2 LOI肿瘤细胞中,原本沉默的母源IGF2被激活的机制我们知之甚少。印记控制区(ICR)在各报道中并不一致,且IGF2启动子区的表观遗传操控元件还没有被研究清楚。所以,我们通过研究与IGF2启动子相互作用的分子,来揭示IGF2表达的调控机制。本研究表明,miR-483能够导致IGF2 LOI。研究方法:1.使用Cas9引导的染色体免疫共沉(Cas9-guided chromatin immunoprecipitation,Cas IP)拉下来与IGF2启动子相互作用的候选分子。在这个实验中,携带有突变Cas9(d Cas9)和两个Cas9 g RNA的慢病毒载体稳定转染入靶细胞。d Cas9是一个没有剪切活性的CRISPR Cas9突变,不能进行DNA切割,但是可以结合到g RNA引导的基因靶点上。我们用Cas9抗体和免疫磁珠将Cas9-g RNA-IGF2启动子染色质复合物沉淀,并用miRNA测序试剂盒检测其中的miRNA。与Cas9-g RNA-随机序列沉淀物相比,我们发现IGF2内含子来源的miR-483-5p与IGF2启动子特异性结合。运用miR483-5p亲和结合共沉淀(miR483-5p IP)验证二者结合,即借助生物素标记的miR-483-5p转染肿瘤细胞系HCT116和ASPC-1,链霉素磁珠沉淀miR-483-5p,继而通过PCR验证复合物中包括IGF2启动子。2.确定了miR-483-5p与IGF2启动子的结合后,我们制作了miR-483、miR-483-5p、anti-miR-483、anti-miR-483-5p、空白对照质粒和相应慢病毒,用于研究miR-483的功能。用上述病毒感染HCT116和ASPC-1肿瘤细胞,并筛选出稳定转染细胞。接下来,我们对稳定转染细胞和正常肿瘤细胞系的增殖、侵袭、迁移、克隆形成等功能,和下游IGF2 m RNA、IGF-II蛋白、磷酸化AKP水平进行比较分析,研究miR-483对细胞功能和IGF2信号通路的影响。3.研究miR-483和miR-483-5p对IGF2基因印迹的影响。因为IGF2是一个印记基因,在HCT116和ASPC-1肿瘤细胞中我们能够通过Apa1多态位点检测两个等位基因的表达。在过表达miR-483和miR-483-5p和未处理细胞中,我们通过PCR和Apa1酶切检测了IGF2的印记水平。4.为了研究miR-483-5p介导的IGF2 LOI机制,我们运用用染色质免疫共沉淀(Ch IP)检测IGF2启动子区域H3K27甲基化水平。在IGF2启动子H3K27单等位基因甲基化中,CTCF(CCCTC接合因子)和SUZ12(多梳蛋白复合物的接合因子)与染色质的作用是必要的,我们通过Ch IP检测了IGF2印记调节蛋白CTCF和SUZ12的总量和其在miR-483-IGF2复合物中的水平,来揭示miR-483-5p影响IGF2表达的分子机制。实验结果:1.通过Cas IP实验发现,IGF2启动子P2可与IGF2第7内含子来源miR-483-5p结合。运用miR-483-5p IP实验,我们沉淀了miR-483-5p和其结合成分,对产物进行q PCR也验证了二者的相互作用。2.感染慢病毒使结肠癌细胞系HCT116和胰腺癌细胞系ASPC-1稳定表达miR-483和miR-483-5p,与对照组肿瘤细胞系相比,miR-483组和miR-483-5p组增殖、侵袭性、迁徙速度、克隆形成能力均增加,且IGF2 m RNA、IGF-II蛋白量、磷酸化AKT水平均增高。而转染anti-miR-483-5p的细胞miR-483-5p水平下贱,上述指标表现出相反的改变。3.结肠癌细胞系HCT116和胰腺癌细胞系ASPC-1均为IGF2印记正常的肿瘤细胞系,即只表达父源等位基因。这两个细胞系均可用多形性限制酶Apa1来区分父源和母源等位基因,从而进行印记分析。基因组DNA(g DNA)包含“A”和“C”两个等位基因。在正常印记的c DNA中,只有“A”等位基因产物(不能被Apa1酶切,171 bp)能被检测到,表现出典型的单等位基因表达。但是,在miR-483和miR-483-5p克隆中,我们发现“C”等位基因(Apa1酶切产物为111 bp和60 bp)也能被检测到。这些数据提示,对于MOI的细胞系HCT116和ASPC-1细胞,印记的母源等位基因被miR-483和miR-483-5p激活。4.miR-483和miR-483-5p的LOI HCT116和ASPC-1细胞与MOI对照组比较发现,LOI细胞印记IGF2启动子(P2-4)的H3K27甲基化显著减少。且CTCF和SUZ12与IGF2印记启动子(P2-4)结合减少,而非印记启动子(P1)不受影响。实验结论1.IGF2内含子来源miR-483-5p可与IGF2启动子P2结合;2.外源表达miR-483-5p可促进IGF2表达,通过IGF1R/AKT通路促进肿瘤发生发展;3.IGF2印记正常的结肠癌细胞系HCT116和胰腺癌细胞系ASPC-1中,外源表达miR-483-5p可使IGF2印记缺失(LOI),母源等位基因表达;4.Mi R-483-5p使IGF2印记缺失(LOI)的机制为:减少CTCF和SUZ12与IGF2启动子的结合,降低H3K27甲基化水平,从而使沉默的母源基因表达。本实验的意义在于:发现了miRNA在基因印记调节中的作用。miR-483-5p是一个促癌内含子miRNA,是一个重要的IGF2印记调节分子。与IGF2启动子P2结合后,减少了CTCF、SUZ12与IGF2启动子的结合,进而减少了H3K27甲基化,使母源等位基因表达,即IGF2印迹缺失。miR-483-5p通过改变IGF2印记上调IGF2表达,同时增强肿瘤复制、迁移、侵袭和克隆形成能力。miR-483-5p造成的IGF-II生长因子过表达可能通过IGF1R/AKT通路促进肿瘤发生,而加入anti-miR-483-5p可逆转这一效应。这些数据表明了致瘤的miR-483-5p促进肿瘤生长的一个新的作用途径,也给调控肿瘤IGF2表达提供了新的思路。

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