六种病原微生物微量快速现场检测技术的建立及检测箱组研制

六种病原微生物微量快速现场检测技术的建立及检测箱组研制
作 者 : 李争
学位授予单位 : 吉林农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王兴龙
学位年度 : 2015
关键词 : 病原;快速检测;检测箱组
摘 要 : 如今我国经济的发展已逐步与世界经济接轨,经济方面的快速崛起给国家和人民带来便利的同时,还存在一系列问题,生物安全问题作为其中之一,其影响力不容忽视。近些年来,口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、新城疫、布鲁氏菌、大肠杆菌O157:H7等感染在世界范围内不断发生,对公共卫生安全构成了巨大威胁,也产生了巨大危害。目前,国内外对以上六种病原的检测主要依靠血清学诊断技术,存在的问题是所用的诊断方法特异性、敏感性较低。病原学诊断方法研究较少,方法参差不齐,实用的方法少,可用于现场快速检测的方法更少。本研究针对上述问题进行检测方法的优化及评价,选择可应用于现场检测的仪器组装并研制检测箱组,包括样品处理箱、核酸快速检测箱和免疫学快速检测箱,可以完成PCR、ELISA、胶体金等多种检测方法,为今后进行疫病的现场检测提供快速、方便、有效的技术手段。首先,针对六种不同的病原微生物,查阅相关中外文献,选用具有代表性的引物进行筛选,选用三种不同的Taq酶:康为世纪Es Taq MasterMix酶、Ahram High-speed酶、Takara ExTaq酶。由于试验用到的仪器均为微型化仪器,程序设置及机器参数等与常规实验室仪器不同,进行条件摸索十分必要。将实验室保存的羊布鲁氏菌M5、牛布鲁氏菌104M、猪布鲁氏菌S2、大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、小肠耶尔森氏菌、单增李斯特菌、鲍氏不动杆菌、猪链球菌2型、沙门氏菌甘油菌复苏增菌计数,将新城疫、口蹄疫、猪瘟进行细胞培养扩增后测定滴度,将非洲猪瘟质粒转化后扩增。其次,将本试验检测用到的口蹄疫、猪瘟、新城疫三种扩增培养后的病毒,提取相关的RNA进行反转录RT-PCR实验方法的建立;非洲猪瘟提取质粒后进行PCR方法建立;布鲁氏菌、大肠杆菌O157:H7两种细菌进行扩增培养,提取相关的DNA进行PCR实验方法的建立。建立的方法从特异性、敏感性和重复性三个方面进行评价。建立PCR方法之后,采用该方法扩增相应的基因序列进行琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶成像系统进行结果的初步判定。将通过初步判定的目的片段进行胶回收并连接pMD-18T载体进行序列测定,测序结果相似性均为99%以上。最后,购买病原检测ELISA试剂盒,对大肠杆菌O157:H7、猪瘟人工污染样品进行检测,并以PCR检测结果为“金标准”,对应用检测箱组完成的ELISA结果进行简要评价,结果显示ELISA试剂盒能够成功检测出相应的病原,具有良好的效果。

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