虫媒病病原多重液相芯片检测方法的建立

虫媒病病原多重液相芯片检测方法的建立
作 者 : 王晶
学位授予单位 : 山西农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 胡永婷;韩雪清
学位年度 : 2015
摘 要 : 目的:虫媒病是指以昆虫作为媒介通过吸血传播造成人畜感染的一类疾病。本研究利用液相芯片技术建立虫媒病多重病原的检测方法。方法:根据蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、Q热贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、西尼罗病毒(WNV)、莱姆病伯氏疏螺旋体(BB)、水泡性口炎病毒(VSV)、裂谷热病毒(RVFV)、埃博拉病毒(EBV)和施马伦贝格病毒(SBV)的高度保守区域分别设计了10对引物与10种探针。选用不同编码的磁性微球分别与10种虫媒病的特异性探针进行有效偶联。在此基础上,通过上下游引物比例、液相杂交温度、液相杂交时间等关键因素的优化,建立了10种虫媒病原的多重液相芯片检测体系。随后对该多重液相体系的特异性、灵敏度和重复性进行验证。结果:通过PCR/RT-PCR扩增得到的片段与预期大小相吻合。将纯化后的PCR产物与载体连接构建阳性质粒,经过DNAMAN分析比对,其同源性均大于97%。当引物比例为1:2,杂交温度为50℃,杂交时间为30min时,每种虫媒病的荧光中位值明显高于背景值,能有效、特异的检测出目的片段。结果显示整个体系对口蹄疫、小反刍兽疫等疫病无交叉反应,最小检出量是102拷贝数并且具有良好的重复性。利用建立的多重液相芯片体系对已知虫媒病原混合样品和300份蚊、蜱、蠓的未知核酸进行检测,发现病原均为阳性且内蒙古呼伦贝尔6只蜱中携带伯氏疏螺旋体。结论:本研究成功建立了能同时检测十种虫媒病病原的液相芯片方法,为多种虫媒病原高通量快速筛查搭建了技术平台,这对动物虫媒性疫病的防控以及鉴定等都将具有重要意义。

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