犬细小病毒抗原及抗体检测方法的建立

犬细小病毒抗原及抗体检测方法的建立
作者 : 周灵
学位授予单位 : 吉林农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 崔尚金;钱爱东
学位年度 : 2017
摘要 : 犬细小病毒性肠炎(Canine parvovirus enteritis)是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种高度接触性传染病,病犬主要的临床症状表现为急性出血性肠炎,呕吐,白细胞减少。该病具有高度的传染性,极易传播,主要引起幼犬发病,成年犬也会发病,死亡率达80%,隐性感染病犬具有传染的可能性。对我国养犬业带来极大的危害。现在临床上还有没特定的药物可以治疗该病,只能通过疫苗免疫来预防发病。该病在早期防治具有一定的效果,因此,需要建立一种在早期感染时能快速、准确的做出检测的方法。本研究从抗原检测和抗体检测出发,建立了快速的检测方法。一、病原学检测方法的建立及应用应用CPV VP2基因保守序列设计一对能扩增574bp的引物,优化反应体系和反应条件,建立了快速、灵敏的犬细小病毒纳米PCR检测抗原的方法。纳米PCR敏感性试验表明比常规PCR高出1000倍,最低核酸检出量为10个拷贝数量级/μL;特异性试验表明与其它病毒无交叉反应。分别采用纳米PCR和常规PCR,对北京市、吉林省、广西省送检的46份临床样品进行检测,CPV阳性率分别为93.4%(43/46)和78.3%(36/46),试验表明该纳米PCR检测方法具有更高的敏感性,更适用于CPV低含量临床样品的检测。采集了用纳米PCR检测犬细小病毒为阳性的犬的粪便,在F81细胞上增殖培养,将分离的病毒通过PCR、血凝、免疫过氧化物酶单层细胞染色(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)试验和基因测序分析。结果表明:PCR试验显示有574bp特异性目的片段;病毒能够使猪红细胞凝集;IPMA检测结果显示为阳性;基因测序分析表明该分离毒株为犬细小病毒,命名为CPV-2c-Guangxi23,但CPV-2c发生了267(F)→267(Y)、324(Y)→324(I)2个位点突变。本试验结果为进一步了解犬细小病毒的变异规律、疫苗株的选择和犬细小病毒病的有效防控奠定了基础二、抗体检测方法的建立建立了犬细小病毒抗体的IPMA检测方法。应用实验室制备的抗犬细小病毒的阳性血清来建立IPMA检测方法,IPMA反应条件的优化结果表明,当病毒含量以原液病毒100倍稀释;阳性血清以1:100;HRP-SPA二抗以1:3000条件时结果最佳,敏感性试验表明阳性血清在1:2000时仍有阳性反应,与其它病毒的阳性血清无交叉反应,表明特异性良好。对46份的临床血清样品进行检测,阳性率为65.2%(30/46)。该方法为CPV的血清学检测提供了一种新技术,为开展犬细小病毒流行病学调查提供了一种简便快速的辅助手段。