大熊猫犬瘟热和小熊猫犬细小病毒病病原调查及犬细小病毒免疫血清与疫苗的研制

大熊猫犬瘟热和小熊猫犬细小病毒病病原调查及犬细小病毒免疫血清与疫苗的研制
作者 : 岳进华
学位授予单位 : 西北农林科技大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 陈德坤
学位年度 : 2016
摘要 : 犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病,临床上以厌食、双相热、结膜炎、严重胃肠炎和神经症状为主要典型特征。犬细小病毒病(canine parvovirus,CP)是由犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的一种急性、出血性肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征的传染病。CDV和CPV的易感宿主范围不断扩大,可在大量物种间进行种内和种间传播。近些年来,大熊猫感染CDV和小熊猫感染CPV均有报道。目前尚无针对大熊猫和小熊猫的特异性免疫CDV血清、免疫CPV血清,以及相应的疫苗。本研究采用PCR检测和基因序列测定、细胞培养试验、病毒回归动物试验、病毒灭活试验、免疫接种、中和试验等方法,调查了陕西楼观台大熊猫繁育基地大熊猫犬瘟热和福州熊猫世界小熊猫犬细小病毒病的流行现状,对导致楼观台大熊猫死亡的犬瘟热病毒和导致福州熊猫世界小熊猫死亡的犬细小病毒进行分离鉴定、犬细小病毒灭活疫苗研制及免疫效果评估。研究获得如下结果:1.陕西楼观台大熊猫CDV抗凝血检出率为16%,棉拭子检出率为28%;采集陕西楼观台犬瘟热死亡大熊猫的心脏、肺、肝病料,预处理后接种Vero细胞,盲传到第5代时,vero细胞出现圆缩、聚集、脱落等病变;PCR扩增CDV N蛋白基因,得到一个287bp扩增片段,测序结果显示其与已发表的CDV山东毒株(亚洲-I型)的相似性为98%;细胞培养试验测得该毒株的TCID50为10-5.2/mL;幼犬感染该毒株后,出现体温升高、鼻头发干、拉稀、眼鼻分泌出水样分泌物等症状。证明成功分离到导致楼观台大熊猫死亡的犬瘟热病毒株,命名为LG株。2.福州熊猫世界小熊猫外周血中CPV检出率为10.0%,棉试子中CPV检出率为10%。导致小熊猫死亡的CPV阳性样品经过处理后接种到F81细胞上,盲传到第5代时细胞产生病变(CPE)明显,病变细胞出现拉网、圆缩、崩解、脱落。PCR扩增VP2基因,得到一个452 bp目的片段。测序结果显示其与CPV-北京毒株的同源性为100%。表明导致小熊猫死亡的CPV毒株分离成功,命名为CPV FZ株。3.细胞培养扩增CPV毒株,测定病毒TCID50为10-5.6/50μL。甲醛灭活完全,灭活疫苗与筛选的转移因子铝胶盐佐剂混合灭活疫苗,免疫犬3次后获得免疫血清中和抗体能效价为1:28.6。免疫犬攻毒后未发病,其中和抗体效价为1:211。结论:成功分离出CDV强毒LG株和CPV强毒FZ株;建立了CPV的灭活疫苗制备方法及相应的免疫程序,免疫试验证明疫苗免疫效果良好;获得了相应的灭活疫苗和免疫血清。上述结果为大熊猫和小熊猫2种疫病的免疫防控提供了参考依据。