羊口疮病毒蛋白086的蛋白水解分子特性研究

羊口疮病毒蛋白086的蛋白水解分子特性研究
作者 : 王小平
学位授予单位 : 南方医科大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 罗树红
学位年度 : 2015
关键词 : 羊口疮病毒；ORFV086蛋白；蛋白水解；水解位点
摘要 : 羊传染性脓疱病(Off),俗称羊口疮,是由羊口疮病毒(orf virus, ORFV)感染引起的一种急性接触性传染病。主要感染山羊和绵羊,典型特征为患羊口鼻等处粘膜和皮肤形成红斑、溃疡、丘疹、脓疮和疣状厚痂。本病常呈群发性流行,最易感染3-6月龄的羔羊。目前,该病在美洲、欧洲、非洲等一些主要养羊国家广为分布,严重威胁着世界养羊业的发展和人类的健康,是羊的主要疫病之一。在我国东北、西北、西南等地区的吉林、黑龙江、青海、新疆、内蒙等省,Off也均有不同程度的爆发,其中一些地区非常严重,制约了我国养羊业的发展。该病毒的抵抗力强,羊群一旦被感染则很难清除且可持续危害羊群多年,给畜牧业造成一定的危害。羊口疮病毒(orf virus, ORFV)属痘病毒科副痘病毒属,是该属的代表种。是已知的病毒颗粒体积较大的双链DNA病毒。电镜下,该病毒呈砖形或卵圆形,病毒表面呈绳索样纵横交错排列结构。且病毒颗粒结构复杂,有核心、侧体和包膜。病毒基因组全长大约138kb, GC含量高达64%,推测其含有132个基因。基因组两端的基因(ORF001-008, ORF112-134)变异较大,编码免疫调节蛋白；而在基因组中部的基因(ORF009-ORFV111)则很保守,对病毒复制、装配和形态发生过程起关键作用。目前关于ORFV病毒的复制、装配、形态发生及免疫机制的研究较少。我们实验室的前期研究已获得了一株单克隆抗体5F2D8,经免疫沉淀及质谱鉴定,发现该抗体能够特异性识别ORFV086蛋白。生物信息学分析发现,ORFV086基因位于病毒基因组的中间区域,为高度保守的基因,推测其在病毒的复制、装配和形态发生过程中起关键作用。对不同的ORFV病毒株分析显示,ORFV086基因编码的结构蛋白表达在细胞内病毒粒子核心,并且该蛋白与痘苗病毒P4a蛋白及其他痘病毒同系物结构相似。在痘苗病毒中,P4a蛋白大约占病毒粒子干重的14%,为病毒含量最丰富的结构蛋白。其由A10L基因编码,在病毒感染晚期形成,大小约102kDa,之后在GGA和GGS位点发生蛋白水解形成大小分别为62kDa、23kDa、9kDa的三个片段。这一蛋白水解过程对痘苗病毒子代粒子的装配,形态发生和成熟有着重要的作用。且核心蛋白形态发生的蛋白水解只发生在未成熟病毒(Ⅳ)向细胞内成熟病毒(IMV)的转变过程中,使得球形的Ⅳ变为砖形的IMV。目前认为,在感染性病毒粒子装配过程中,核心蛋白的水解加工是病毒成熟过程中的一种普遍现象。对于痘苗病毒(vaccinia virus,VV),核心蛋白发生蛋白水解的特点是：(1)含有一个AGX模体；(2)在该病毒感染晚期表达；(3)包装入装配的病毒粒子,组成病毒粒子核心。负责病毒蛋白水解加工的蛋白酶通常由病毒自身编码。其他DNA病毒,例如腺病毒和非洲猪瘟病毒的复制及形态发生过程中,病毒核心蛋白也发生了特异性蛋白水解。与VV病毒核心蛋白发生水解的AGX膜体不同,腺病毒核心蛋白发生水解的位点是Gly-Gly-X膜体。同样地,非洲猪瘟病毒的三个核心蛋白也是在Gly-Gly-X膜体发生蛋白水解。病毒核心蛋白发生蛋白水解已经成为许多DNA病毒和RNA病毒复制周期中的一种普遍现象。NA1/11株的ORFV086基因全长2718bp,编码的ORFV086蛋白大小为100.05 kDa。生物信息学分析发现,ORFV086蛋白与痘苗病毒P4a蛋白及其他痘病毒同系物结构相似。ORFV086蛋白是否具有类似于VVP4a蛋白的蛋白水解现象?目前还没有文献报道。本研究的目的是鉴定ORFV086蛋白的水解位点及其蛋白水解的分子特性,为了解ORFV的复制、装配、形态发生及成熟过程奠定基础。通过基因克隆技术,成功构建并原核表达了重组的ORFV086全长蛋白,免疫兔子制备ORFV086多克隆抗体。该多克隆抗体能应用于ORFV086蛋白的检测,从而为ORFV086蛋白的进一步研究奠定基础。通过氨基酸序列比对及系统进化树分析,预测ORFV086蛋白可能的水解位点。结果显示,ORFV086为一个高度保守的结构蛋白,与P4a蛋白的AGS及AGT水解位点不同,其预测的蛋白水解位点为GGA,GGS。对ORFV086全长蛋白的氨基酸序列进行AGX膜体检索,发现AGP,AGK及AGL均是AGX膜体,这五个位点都有可能是ORFV086蛋白的水解位点。根据所预测水解位点位置,通过基因克隆技术成功构建了含ORFV086全长或不同大小ORFV086片段的12个重组质粒。为鉴定ORFV086是早期基因还是晚期基因,进行了动力学分析。PCR检测发现,病毒感染后8h开始检测到ORFV086基因的合成,且该基因合成能被阿糖胞苷(AraC)抑制,说明ORFV086是一个晚期表达基因。然而,Western blot分析时,病毒感染后3h开始就可以检测到ORFV086全长蛋白以及一条21kDa片段,但是其他条带均需在第24h才可以检测,这与PCR结果不相符。进一步的Pulse-chase实验发现,在病毒感染后5h进行pulse可以检测到ORFV086蛋白的合成,而在3h却没有检测到该蛋白。这也证明ORFV086是一个晚期基因。为确定ORFV086蛋白水解位点的位置,将N端或C端带有flag标签的12个重组质粒分别转染OFTU细胞,加入NA1/11病毒进行水解实验,通过Flag抗体以及ORFV086多克隆抗体检测ORFV086蛋白的水解条带。经Flag抗体分析发现,在加入ORFV后,2B-086,2B-N-GGS以及2B-N-GGA均可以检测到两条大小分别为45kDa,25kDa的特异性条带,因其是N端带有flag标签,可推测其水解位点均位于N-GGA之间。然而,2B-GGA-C以及2B-GGS-C均没有检测到除目的条带以外的其他水解条带。进一步的ORFV086多克隆抗体分析发现,加入ORFV后,2B-086,2B-N-GGS,2B-N-GGA,2B-GGA-C, 2B-GGS-C,2B-GGA-GGS均可以检测到5条大小分别为100kDa,33kDa,30kDa, 25kDa以及21kDa的条带。有趣的是,2B-GGS-C加入ORFV后还能特异性识别一条大小约23kDa条带,且该23kDa条带的大小与位置都与2B-GGS-C重组蛋白一致,这表明该23kDa条带很有可能就是2B-GGS-C。C端带有flag标签的重组质粒经Flag抗体分析,加入ORFV后,4A-086及4A-GGA-C检测到一条约23kDa的特异性条带,推测该23kDa条带是在GGS位点水解形成的4A-GGS-C4A-N-GGS和4A-N-GGA加入ORFV后检测到一条45kDa特异性条带,推测该45kDa条带的水解位点位于N-GGA之间。4A-GGS-C没有看到除目的条带以外的其他水解片段。进一步ORFV086多克隆抗体分析发现,加入ORFV后,4A-086,4A-N-GGS,4A-N-GGA,4A-GGA-C,4A-GGS-C,4A-GGA-GGS均可以检测到5条大小分别为100kDa,33kDa,30kDa, 25kDa以及21kDa的条带。有趣的是,4A-086,4A-GGA-C及4A-GGS-C在加入ORFV后,用ORFV086多克隆抗体能特异性识别一条23kDa条带,并且该23kDa条带大小与位置都与4A-GGS-C重组蛋白一致。这表明该23kDa条带很有可能就是4A-GGS-C。4A-GGS-C+ORFV中的23kDa条带是真核表达的重组蛋白4A-GGS-C。然而,4A-086+ORFV和4A-GGA-C+ORFV分别转染的是4A-086和4A-GGA-C重组质粒,重组蛋白应该分别只有4A-086和4A-GGA-C,那么在加入ORFV后,4A-086和4A-GGA-C出现的23kDa条带就很有可能是在GGS位点水解形成的4A-GGS-C片段,并且这与用flag抗体检测的结果是一致的。以上结果表明ORFV086在GGS位点发生了水解作用。为进一步确定23kDa条带的水解位点,我们分别将4A-086全长中的AGP,AGK,AGL,GGA和GGS位点突变为IDI。构建的突变体分别转染OFTu细胞,比较加入ORFV组与未加ORFV组的条带差异。经Flag抗体和ORFV086多克隆抗体分析发现,加入ORFV病毒后,除将GGS位点突变为IDI的突变质粒4A-GGS-IDI没有检测到23kDa的条带外,其他突变体和4A-086均能检测到该23kDa条带。这说明23kDa条带是ORFV086在GGS位点进行蛋白水解后形成的产物4A-GGS-C。以上结果进一步表明ORFV086在GGS位点发生了蛋白水解作用。进一步对ORFV086蛋白进行非放射性pulse-chase分析,结果显示,21kDa条带为ORFV086蛋白的一个水解产物；23kDa条带为4A-086蛋白的一个水解产物。这也进一步证实4A-086在GGS位点发生了蛋白水解,水解形成产物4A-GGS-C大小为23kDa。值得注意的是,在chase标记蛋白中,还可以检测到ORFV086全长和4A-086全长蛋白,这表明ORFV086蛋白或者4A-086蛋白均没有完全发生蛋白水解,也即只有一部分的全长蛋白发生蛋白水解。这与前面推测ORFV086全长及其21kDa水解蛋白都是组成ORFV成熟病毒粒子的结构蛋白是相符的。通过以上研究,对ORFV086蛋白水解的特性进行了鉴定。ORFV086基因为晚期表达基因。ORFV086蛋白在GGS位点处进行了不完全水解,形成产物GGS-C。与VVP4a蛋白不同,全长的ORFV086蛋白及其水解产物GGS-C可能均是组成成熟ORFV病毒粒子的结构蛋白。除GGS为水解位点外,ORFV086可能也在N-GGA片段的其他位点发生了蛋白水解。这些研究为了解ORFV的复制、装配、形态发生及成熟过程奠定基础,进一步为病毒控制、预防治疗提供新的疫苗和佐剂靶标。