人MxA转基因克隆猪的制备及初步研究
作 者 : 赵翊丞
学位授予单位 : 吉林大学
学位名称 : 博士
导师姓名 : 欧阳红生
学位年度 : 2013
关键词 : MxA蛋白；猪瘟病毒；核移植；转基因猪
摘 要 : 目前发现人MxA蛋白对小RNA病毒具有广泛的抑制作用，这种由I型干扰素IFNα/β诱导产生的蛋白是天然免疫抵抗病毒感染过程中最具有研究意义的决定因子之一。MxA主要由氨端结构域，中间结构域及羧端GTP酶活性结构域组成，是大GTP酶动力蛋白超家族的一员，该家族在胞内调控、运输等过程中担任重要作用。研究已证实MxA对本杨科病毒、正粘病毒,副粘病毒、棒状病毒、披膜病毒和乙肝病毒等RNA病毒和DNA病毒都存在高效抗性。猪瘟是一种严重的传染性疾病，目前针对猪瘟的防治手段主要包括预防接种免疫及大规模扑杀。尽管许多国家已经宣布采取有效措施控制了猪瘟的肆虐，但近几年猪瘟在世界各地区仍时有爆发。作为畜牧业的主要产品，目前认为猪是猪瘟的唯一易感哺乳动物，且猪瘟可于家猪间迅速传播与扩散。引发猪瘟的病原为猪瘟病毒，该病毒属于黄病毒科瘟病毒属，是一种由囊膜包被的单股正链RNA病毒。猪瘟病毒的基因组仅包含一个大的开放阅读框，在宿主内可先翻译出一个长链前体多肽，此多肽经胞内相关因子剪切后可形成为多个小的功能与结构蛋白，按照翻译顺序依次为：Npro、C、E0、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。当病原感染宿主后，侵染性颗粒对髓质、淋巴系统有特异嗜性，导致的急性症状包括持续高热、白细胞急剧减少和内出血。由于猪瘟对家畜业的极大危害，研究新的抗病毒策略，以人的MxA蛋白作为新的抗病毒手段，对于加快抗猪瘟育种，以及有效控制猪瘟传播具有急迫的现实意义。Mx蛋白对病毒的抵抗机制主要有二：一是活化的Mx蛋白可通过GTP酶特异的水解某些病毒核衣壳，在胞内核酸外切酶的帮助下降解靶基因组以抵抗病毒；二是Mx蛋白可特异性结合并阻止某些病毒蛋白的转运，从而抑制病毒完整颗粒的包装。目前研究发现人MxA蛋白能够有效干扰一些单链小RNA病毒的早期侵染，除了粘病毒、棒状病毒、披膜病毒还包括小核糖核酸病毒以及非洲猪瘟病毒。尽管MxA的抗毒机制仍未被完全阐释清楚，但其抗毒范围主要集中在单股负链RNA病毒，而MxA对于单股正链RNA的黄病毒科瘟属猪瘟病毒是否存在抑制效应，则未见报道。有文章称猪瘟病毒在侵染宿主细胞时可通过黄属病毒特有的双链RNA机制阻断干扰素诱导Mx蛋白的产生，而补加高浓度的纯品干扰素可以在细胞水平干扰猪瘟病毒的增殖，这一现象暗示我们：宿主内源免疫因子的低量表达可能是造成宿主无法抵御猪瘟病毒的原因之一；干扰素的下游基因可能对猪瘟病毒有一定的抑制作用。为了验证假设并建立新的高效抗猪瘟育种策略，我们分别在细胞水平与转基因动物水平检测了人MxA对猪瘟病毒增殖的影响。为了检测细胞水平MxA是否对猪瘟病毒存在抑制效应，我们基于PGKneotpAlox2系统制备了含有Eflα高效启动子的MxA真核表达载体。经过G-418筛选，分别得到了稳定表达人MxA蛋白的40株猪胎儿成纤维细胞和70株PK-15细胞克隆。经初步检测，我们发现CSFV在MxA阳性细胞株内的早期增殖受到了明显抑制，通过滴度测定、间接免疫荧光检测和实时定量PCR试验，我们首次确认MxA在细胞水平对CSFV有抗毒效果。基于以上研究结果，为进一步探究MxA在动物水平的抗毒效果并提供抗猪瘟育种的可行方案，我们又以MxA阳性胎儿成纤维细胞为核供体，采用体细胞核移植技术成功制备了MxA转基因猪。为了鉴定转基因情况，我们在基因组、RNA、蛋白水平分别进行了PCR、RT-PCR、High-tailPCR、Southern blotting和Western blotting试验，证明所获仔猪均为MxA阳性转基因猪。为了验证抗毒效果，我们又分离、培养了包括脐静脉血管内皮、尾尖和肾脏组织的猪瘟病毒易感细胞，进行了基本的接毒检测。通过与同品种非转基因猪比较，我们发现1号与2号克隆猪细胞内病毒增殖量大大降低，3号猪细胞内的病毒增殖也受到了抑制。结果表明：尽管转基因猪之间的抗毒效果存在差异，MxA蛋白在动物水平对猪瘟病毒的增殖仍具有抵御效应。经过分析，我们认为造成抗毒效果的差异是来自多方面的：克隆猪本身的一些基因可能在发育过程中存在表达差异，这一点能够从出生时的体重差异间接反映出来；MxA的表达在经历核移植重编程及重构胚在代孕猪子宫内发育过程后可能受到了影响而减弱；受分离手法和技术条件限制，我们获得的各组织细胞生长状态不尽相同，这也可能直接导致了抗毒效果的差异。本研究证实了MxA对猪瘟病毒的抑制效应，成功制备了稳定表达人MxA的转基因克隆猪，为体外研究人MxA抗病毒作用提供了前期实验动物模型，也为针对猪瘟的抗病育种研究奠定基础性工作。
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人MxA转基因克隆猪的制备及初步研究_赵翊丞.caj
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