4周前 (10-22)  动物疾病研究与防治相关 |   抢沙发  2 
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非洲猪瘟病毒p30重组蛋白的表达及单克隆抗体制备
作 者 : 储德文
学位授予单位 : 扬州大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 孙怀昌
学位年度 : 2013
关键词 : 非洲猪瘟病毒;p30蛋白;原核表达;单克隆抗体制备
摘 要 : 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种高度致死性传染病,强毒株感染的死亡率高达100%。该病一直在许多非洲国家流行,近年来流行范围有扩大趋势,已传播到格鲁齐亚、俄罗斯等邻国,使我国养猪业面临巨大威胁。ASFV能以软蜱和非洲野猪作为储存宿主和传播媒介,具有复杂的感染与免疫逃避机制,目前无任何疫苗用于防疫,因此快速、准确的诊断对防止该病传入和控制具有重要意义。p30是ASFV的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一,重组p30是非常重要的ASFV诊断抗原。为了制备p30重组抗原和单克隆抗体用于ASFV诊断,本研究将E75株ASFV p30基因序列优化成大肠杆菌密码子偏爱序列,将人工合成的序列插入原核表达载体pET-30a,用重组载体pET-P30转化大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE分析结果显示:表达的His-p30融合蛋白为预期的30kD,主要以包涵体形式表达。用镍柱亲和层析法从重组菌裂解物纯化得高纯度的His-p30融合蛋白,以纯化蛋白为抗原免疫小鼠,每次免疫后采血分离血清。以重组蛋白为包被抗原,用方阵试验确定最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数,用建立的间接ELISA对免疫小鼠血清进行检测,结果显示4次免疫小鼠血清的抗体效价为1:1638400;按照常规的杂交瘤制备方法,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA筛选杂交瘤细胞阳性克隆,用有限稀释法进行亚克隆,经过三次亚克隆后获得两株稳定分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以重组p30为抗原,用杂交瘤细胞培养上清进行间接免疫荧光和Western blot检测,结果显示分泌的单克隆抗体能与p30特异反应;用2株杂交瘤细胞注射小鼠,收集腹水进行抗体效价测定,结果显示3H7A7和6D10G7株杂交瘤腹水单抗的ELISA效价分别为215和217。

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