7种猪病毒性疫病QIAxcel及Bio-Plex检测方法的建立与初步应用
作 者 : 肖璐
学位授予单位 : 四川农业大学
学位名称 : 硕士
导师姓名 : 王印
学位年度 : 2017
关键词 : 猪病；病毒；QIAxcel毛细管凝胶电泳；Bio-Plex液相芯片；Luminex；xMAP；多重检测
摘 要 : 为实现猪伪狂犬病毒(Pseudorabies,PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪流行性日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒 2 型(Porcinecircovirustype2,PCV-2)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)7 种猪繁殖与呼吸系统病毒性病原的同时检测,促进毛细管凝胶电泳及液相芯片高通量检测技术在动物疫病诊断中的应用。首先,针对 PRV-gB、JEV-NS5、CSFV-5’URT、PCV-2-ORF1、PRRSV-ORF6、PPV-VP1及ASFV-P72基因序列,分别设计7对特异引物,在特异性引物的上、下游5’端均添加一段非同源性的标签序列,形成特异性复合引物,并根据标签序列合成一对用于识别标签的通用引物,下游通用引物5’端添加生物素标记;根据各扩增序列分别设计7条特异性的探针,并在各探针的5’端修饰氨基与12个碳臂,用于与羧基磁性微球的共价偶联。其次,依据PCR扩增产物条带大小,将其分成两组,采用普通凝胶电泳技术,对多重扩增反应体系进行初步探讨。再利用毛细管凝胶电泳的高分辨率优势,对7重反应的条件的两个阶段退火温度,特异性引物浓度和通用引物浓度进行直接同步优化,确立PRRSV、CSFV、JEV、PCV、PRV、PPV与ASFV7重PCR的最优扩增条件,从而建立多重PCR与毛细管凝胶电泳分析系统(PCR-QIAxcel)的联用;基于7重PCR扩增体系,应用Bio-Plex液相芯片分析系统,通过杂交反应条件的优化,构建了 7种猪病毒性疫病Bio-Plex液相芯片检测平台(PCR-Bio-Plex),并对两种方法的交叉特异性、灵敏性及反应的重复性进行探讨。最后,将本文所建立的两种检测方法在临床样本的检测中进行应用,并对其进行综合评估分析。结果显示最终确立PCR扩增中最优特异性引物终浓度为0.056 μmol/L/条,通用引物的终浓度为0.64 μmol/L/条,两个阶段的退火温度分别为56 ℃、51 ℃,Bio-Plex杂交体系的最优杂交程序为57 ℃杂交30 min,采用最优的反应条件,PCR-QIAxcel 对 PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、ASFV、PPV 的最低检测量分别为:4.56×103、6.35×103、1.98×103、1.32×104、3.21×103、4.51×103、3.37×103拷贝/μL,PCR-Bio-Plex对上述7种病毒最低的检测限度分别为:2.81×102、2.34×102、2.98×102、2.31×102、2.22×103、2.54×103、2.33×103拷贝/μL。特异性试验结果显示,PCR-QIAxcel及PCR-Bio-Plex的特异性均较高,且与其他病毒无交叉反应。65份临床样本的检测结果显示PCR-QIAxcel共检出47份阳性样本,检出率为88.7%(47/53),PCR-Bio-Plex共检出49份阳性样本,检出率为92.5%(49/53)。PCR-QIAxcel 与 PCR-Bio-Plex 检测结果符合率为 95.9%(47/49)。本文通过反应条件优化,成功建立了 PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 7种病毒PCR-QIAxcel毛细管凝胶电泳及PCR-Bio-Plex液相芯片的检测方法,并对两种方法进行了评估和分析。PCR-QIAxcel与PCR-Bio-Plex检测方法高效、灵活、准确、特异较强、灵敏度较高,Bio-Plex的灵敏度高于QIAxcel约1-2个量级。本文为混合感染的检测方法提供新手段,为对抗外来疫病的检疫、监控提供新思路,对临床样品的快速、准确诊断提供参考,同时,促进高通量检测技术在动物疫病监控的应用与发展,为动物疫病高通量检测技术提供新方向。
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