细胞生物学实验设计(王金发).pdf - 361图书馆
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第一章 细胞概述

1. Miller 证明地球上的有机分子自动合成的装置(图 E1-1)

答: Miller 推测,大气层中含有甲烷和氨,也含有氢和水蒸气。他把这些气体一起放入实验装置中(图 E1-1) ,然后一直与电火花接触,在这一装置中靠沸水提供水蒸气。反应一个星期后分析产物。令人惊讶的是,产物中有大量的有机物, 包括尿素、生物和非生物的氨基酸等, 实验证明了在雷电作用下能够利用大气中的分子合成有机分子。也就是说在进化的某一过程中地球上有了构成细胞生命物质的基本元件:氨基酸、碱基、单糖等,为细胞的起源作好了物质准备。

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图 E1-1 Mi l l er 证明地球上的 有机 分子 自动 合成 的装置

 

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    第二章 细胞Th物学研究方法

    1. 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明的单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) 的实验原理和技术细节有哪些?

    答:1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明了单克隆抗体技术,因此获得 1984 年诺贝尔医学奖。它是将产生抗体的单个 B 淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术, 其原理是: B 淋巴细胞能够产生抗体, 但在体外不能无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性, 既 能 产生抗体,又能无限增殖。

    图 E2-1 所示是单克隆抗体制备流程。首先用一种抗原注射小鼠,引起产生特异抗体的细胞大量增殖,取出小鼠的脾, 分离产生抗体的淋巴细胞,同骨髓瘤细胞进行融合,在 HAT 培养基上进行初步筛选后,经过进一步鉴定,得到生产单克隆抗体的细胞。

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    图 E2-1 单 克隆抗体 技术

    筛选用的 HAT 培养基是选择性培养基, 含有氨基喋呤(aminopterin,A)、次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 和胸腺嘧啶(thymidine,T)。在 HAT 培养基中,只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存,而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。因为,正常的未融合细胞具有核酸合成主要通路和旁路所必需的酶但不能在体外长期生长;突变后的肿瘤细胞只具有RNA 和 DNA 合成所必需的主通路的酶,而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成 DNA 的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黄嘌呤合成 RNA 的磷酸核糖转移酶(HGPRT)。当这些细胞的核酸合成主通路被培养基中氨基喋呤阻断后,则因核酸合成障碍而死亡。只有肿瘤细胞和具有合成旁路酶的正常细胞形成的融合细胞,才能在氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下利用其中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核 酸而得以生存。由于融合细胞具有肿瘤细胞和抗体分泌细胞双重特征,所以在去除氨基喋呤这一核酸阻断剂后即可在正常培养基中长期传代增殖, 并分泌抗体。在 HAT 培养基中生存下来的细胞,可以是各种正常细胞与瘤细胞的融合体, 还可能是多克隆杂交瘤细胞的混合群体,因此须进一步用稀释法分离出单克隆的杂交瘤细胞和筛选出识别特异性抗原的抗体分泌克隆,才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株。

 

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